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高效毛細管電泳色譜儀在DNA測序中的應(yīng)用 
(發(fā)布日期:2017-5-9 9:04:02) 來源:
 
   
高效毛細管電泳色譜儀簡稱毛細管電泳儀(CE),是以毛細管為分離通道,以高壓直流電場為驅(qū)動力,利用荷電粒子之間的淌度差異和分配系數(shù)差異進行分離,是分析科學(xué)繼高效液相色譜儀之后的又一重大進展,使分析科學(xué)從微升級進入到了納升級水平,不僅使單細胞乃至單分子分析成為可能,也使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子分析有了新的轉(zhuǎn)機。
人類基因組計劃對人類基因組DNA全序列測定隨著電泳從平板凝膠電泳、毛細管凝膠電泳、線性高分子溶液毛細管電泳、毛細管陣列電泳,到全基因組測序技術(shù)的發(fā)展,已于2001年宣布提前完成,被公認為是分析化學(xué)家拯救了人類基因組計劃。對其它生物的DNA測序仍在繼續(xù),方向主要是提高測序速度、準確度和大分子片段的認讀長度。人類基因組計劃提前完成的關(guān)鍵是DNA測序方法的改進,而CE就是一種比較適合快速、靈敏、準確、廉價和自動化等要求的方法之一。
一、毛細管凝膠電泳(CGE):
CGE是將平板凝膠電泳的凝膠移到毛細管中作支持介質(zhì)的電泳,可按照分子大小進行分離。常用支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。1990年,首次用CGE進行DNA序列測定的嘗試,并初步獲得成功,隨后凝膠的制備和新分離模式迅速發(fā)展。CGE與LIFD相結(jié)合,成為DNA快速序列分析的優(yōu)選方案之一,并對人類基因組計劃的完成發(fā)揮了重要作用。
二、線性高分子溶液毛細管電泳:
雖然CGE是CE中分離度極高的一種模式,但CGE的凝膠柱制備和應(yīng)用仍然存在問題,如凝膠形成、電泳中氣泡的產(chǎn)生和使用過程中焦耳熱對支持介質(zhì)的降解使毛細管壽命縮短等。而在低粘度的非交聯(lián)線性高分子溶液DNA測序中,高分子溶液可更換,使壽命延長。1993年,首次使用線性聚丙烯酰胺進行DNA測序。隨著技術(shù)的不斷改進,線性高分子溶液毛細管電泳采用程序升溫已用于DNA限制性片段快速分離,采用脈沖電場毛細管進行DNA測序,分離的DNA片段可達1000bp。
三、毛細管陣列電泳(CAE):
一般的CE很難做到傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳所具備的多通道同時分析,利用共焦激光熒光掃描檢測系統(tǒng)解決了由多根毛細管組成的毛細管陣列同時檢測的問題,這一技術(shù)被稱為毛細管陣列電泳(CAE)。CAE無需凝膠,樣品用量少,提高了效率,降低了測序成本,并實現(xiàn)了自動化,加快了速度,但仍有必要進行更高通量的檢測和進一步降低費用。CAE曾成為人類基因組計劃第二個五年計劃(1998~2003年)對DNA測序的三條發(fā)展途徑之一。
檢測器一般分為掃描光學(xué)檢測器和電荷耦合元件(CCD)陣列檢測器兩類。放射性陣列毛細管微板與掃描器聯(lián)用,可實現(xiàn)高通量的DNA檢測,96個樣品采用壓力式毛細管陣列平行進樣,可使96個PBR322限制性內(nèi)切酶片段在120s內(nèi)得到高效分離。若同時使用40塊微板,每塊微板上有384個分離通道,則一次進樣量可達15000個,從而達到高通量DNA分析和測序的目的。此外,CE不僅可對DNA的合成片段進行純度檢驗,對PCR擴增的DNA模板進行純化和從反應(yīng)體系中去除,還可進行文庫建立或復(fù)制,啟動子作用方式檢測自然和人工合成RNA的結(jié)構(gòu)。
   
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