等電聚焦電泳色譜儀是利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點(diǎn)不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的和線性的pH梯度中進(jìn)行分離，等電聚焦電泳的關(guān)鍵是pH梯度的建立。

一、人工建立pH梯度：

在電場(chǎng)下利用不同pH值緩沖液相互擴(kuò)散，在混合區(qū)間形成pH梯度。此pH梯度易受緩沖液離子的遷移和擴(kuò)散而變動(dòng)，重復(fù)性差，已不被采用。

二、利用溫度梯度建立pH梯度：

因?yàn)闇囟瓤捎绊懢彌_液的解離度，使pH值改變。由于每差別一個(gè)pH單位，溫度約差50℃，故這種方法只能建立范圍很窄的pH梯度，而且不易穩(wěn)定。

三、加入附加物建立pH梯度：

把一些有機(jī)溶劑如乙醇和甘油等加到緩沖液中，利用附加物介電常數(shù)的變化來改變緩沖液一些組分的解離常數(shù)，可建立1.5pH單位的pH梯度。如在硼酸鹽溶液中加0～5%甘油和0～3%蔗糖，可建立pH =7～8.6的梯度，可分離血紅蛋白。

四、利用載體兩性電解質(zhì)建立pH梯度：

在電極間放入含多種不同等電點(diǎn)電解質(zhì)的溶液，通電后在電極間形成pH梯度。這些兩性電解質(zhì)大多是一些多胺基多羧酸化合物。為防止對(duì)流對(duì)pH梯度的干擾，可采用加入不同濃度的中性或惰性物質(zhì)形成密度梯度的方法，也可采用在電極間加入凝膠的方法。

五、利用固定化兩性載體建立pH梯度：

把具有緩沖能力的基團(tuán)或化合物用共聚或接枝的方法固定在載體上形成兩性載體。載體是聚丙烯酞胺凝膠和葡聚糖凝膠等，被固定的化合物是帶羧基的酸和帶叔胺基的堿。采用這種方法可形成穩(wěn)定的pH梯度，但成本太高。

六、固定化兩性載體和載體兩性電解質(zhì)相結(jié)合：

在固相pH梯度凝膠中加入載體兩性電解質(zhì)作為添加劑。

七、利用離子交換劑建立pH梯度：

利用離子交換劑建立一個(gè)有pH梯度的柱進(jìn)行等電聚焦。

八、由外循環(huán)建立pH梯度：

溶液在兩電極室內(nèi)進(jìn)行循環(huán)，以在電泳分離室中建立一個(gè)穩(wěn)定的pH梯度。

   

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