聚丙烯酰胺膠電泳色譜儀的電泳體系有連續(xù)體系和不連續(xù)體系，連續(xù)體系是在整個(gè)電泳體系中采用的緩沖液成分、pH和凝膠孔徑都相同，不連續(xù)體系是在電泳體系中采用兩種以上的緩沖液成分、pH和凝膠孔徑。其中不連續(xù)體系的盤狀凝膠電泳最為常用。

一、盤狀凝膠電泳體系組成：

1、凝膠層：

（1）樣品膠：T = 3.1%，C = 20%

（2）濃縮膠：T = 3.1%，C = 20%

（3）分離膠：T = 7.2%，C = 2.6%

2、緩沖液離子組成和pH：

（1）電極緩沖液：pH = 8.3的Tris－甘氨酸緩沖液

（2）樣品膠緩沖液：pH = 6.8的Tris－HCl緩沖液

（3）濃縮膠緩沖液：pH = 6.8的Tris－HCl緩沖液

（4）分離膠緩沖液：pH = 8.9的Tris－HCl緩沖液

3、電位梯度：

在電場中自然形成不連續(xù)的電位梯度。

二、盤狀凝膠電泳工作原理：

在盤狀凝膠電泳的不連續(xù)體系中，存在樣品的濃縮效應(yīng)、凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。

1、濃縮效應(yīng)：

（1）凝膠層的不連續(xù)性：

1）樣品膠：為大孔膠，采用光聚合法制備。樣品預(yù)先加在其中，起防止對流的作用，避免樣品跑到上面的緩沖液中。目前電泳一般不制作此膠。

2）濃縮膠：為大孔膠，采用光聚合法制備。起防止對流的作用，樣品在其中濃縮，并按其遷移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界面處濃縮成薄層。

3）分離膠：為小孔膠，采用化學(xué)聚合法制備。樣品在其中進(jìn)行電泳和分子篩分離，起防止對流的作用。蛋白質(zhì)分子在大孔凝膠中受到的阻力小，移動(dòng)速度快。進(jìn)入小孔凝膠時(shí)受到的阻力大，移動(dòng)速度減慢。由于凝膠層的不連續(xù)性，在濃縮膠與分離膠的界面處使樣品濃縮，區(qū)帶變窄。

（2）緩沖液離子組成的不連續(xù)性：

在電場中如有兩種電荷符號(hào)相同的離子向同一方向移動(dòng)，其遷移率不同，兩種離子若能形成界面，則跑在前面的離子稱為快離子（前導(dǎo)離子），跑在后面的離子稱為慢離子（尾隨離子）。為了使樣品達(dá)到濃縮的目的，需在緩沖液中加入有效遷移率不同的兩種離子，并使這兩種離子在緩沖液中組成不連續(xù)的兩相，即在三層凝膠中加入快離子，在電極緩沖液中加入慢離子。為了保持溶液的電中性和一定的pH值，需加入一種與快、慢離子電荷符號(hào)相反的離子，稱為緩沖配對離子，使緩沖配對離子分布于全部緩沖液中，即三層凝膠緩沖液和電極緩沖液中。

如分離蛋白質(zhì)時(shí)，通常采用氯離子（Clˉ）為快離子，甘氨酸根離子（(NH₂CH₂COOˉ）為慢離子，三羥甲基氨基甲烷（Tris⁺）為緩沖配對離子。

電泳開始前，慢離子位于兩個(gè)電極槽中，快離子分布于三層凝膠中，樣品在樣品膠中，緩沖配對離子分布于全部緩沖液中。電泳進(jìn)行時(shí)，快離子與慢離子的界面向下移動(dòng)。由于選擇適當(dāng)?shù)膒H值緩沖液，使蛋白質(zhì)的有效遷移率介于快、慢離子之間，而濃縮成為極窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品到達(dá)濃縮膠與分離膠的界面處時(shí)，離子界面繼續(xù)前進(jìn)，蛋白質(zhì)被留在后面，然后被分成多個(gè)區(qū)帶。

（3）緩沖液pH的不連續(xù)性：

在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，要求在樣品膠和濃縮膠中，慢離子比所有被分離樣品的有效遷移率都低，使樣品夾在快離子與慢離子的界面之間被濃縮。而在分離膠中，慢離子的有效遷移率比所有被分離樣品的有效遷移率都高，使樣品不再受離子界面的影響。

電極緩沖液pH = 8.3，甘氨酸的電離小，有效遷移率小。濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大。蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于快、慢離子之間。電泳開始后，氯離子跑得最快，留下一低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度，使甘氨酸根離子追趕氯離子，蛋白質(zhì)夾在中間被壓縮。

（4）電位梯度的不連續(xù)性：

在不連續(xù)體系中，電位梯度的差異是自然形成的。電泳開始后，由于快離子的遷移率最大，會(huì)很快超過蛋白質(zhì)，在快離子的后邊形成一個(gè)離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。由于電導(dǎo)與電位梯度成反比，低電導(dǎo)區(qū)的電位梯度較高。高電位梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動(dòng)。當(dāng)快離子、慢離子和蛋白質(zhì)的有效遷移率與電位梯度的乘積分別相等時(shí)，則三種離子的移動(dòng)速度相同。快、慢離子的移動(dòng)速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立后，在快、慢離子之間形成一個(gè)穩(wěn)定而又不斷向正極移動(dòng)的界面，即在高、低電位梯度區(qū)之間形成一個(gè)迅速移動(dòng)的界面，由于蛋白質(zhì)的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，因此就聚焦在這個(gè)移動(dòng)的界面附近，被濃縮成一個(gè)狹小的中間層。

2、分子篩效應(yīng)：

離子界面到達(dá)濃縮膠與分離膠的界面處時(shí)，凝膠的pH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的解離迅速增加，有效遷移率超過蛋白質(zhì)，隨之高電位梯度消失，蛋白質(zhì)在均一的電位梯度和pH條件下通過一定孔徑的分離膠。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的相對分子量和構(gòu)象不同時(shí)，通過分離膠所受到的阻力不同，因遷移率不同而被分開。凝膠這種分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力，這種現(xiàn)象稱為分子篩效應(yīng)。

3、電荷效應(yīng)：

蛋白質(zhì)在濃縮膠與分離膠的界面處被高度濃縮，堆積成層，形成一狹小的高濃度的蛋白質(zhì)區(qū)帶，但由于每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。承載有效電荷多的，移動(dòng)速度快，反之則慢。因此各蛋白質(zhì)以一定的順序排列成多個(gè)圓盤狀。

綜上所述，樣品的濃縮效應(yīng)是在濃縮膠中進(jìn)行，分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)主要是在分離膠中進(jìn)行。在蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠時(shí)，由于在濃縮膠中的慢離子跑到蛋白質(zhì)前面，高電位梯度消失，使蛋白質(zhì)進(jìn)入均一的電位梯度和pH的分離膠中。此時(shí)，又由于分離膠的孔徑小，各蛋白質(zhì)因分子大小和形狀不同而被阻滯的程度不同，使一些即使是凈電荷相同的蛋白質(zhì)分子也因分子篩效應(yīng)不同而得到分離。

   

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