高效毛細管等電聚焦電泳色譜儀（CIEF）是以載體兩性電解質(zhì)為介質(zhì)，根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術。

一、載體兩性電解質(zhì)應具備的條件：

載體兩性電解質(zhì)是兩性分子，使其在電泳柱中能達到一個平衡位置。載體兩性電解質(zhì)可作為載體，但兩性電解質(zhì)不能用于等電聚焦。只有載體兩性電解質(zhì)，即具有好的電導和緩沖能力的化合物才能用于等電聚焦。

1、易溶于水，在pI處應有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pH梯度，不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變pH梯度。

2、在pI處應有良好的電導和相同的電導系數(shù)，以保持均勻的電場。

3、分子量小，易與被分離物分開。

4、本身紫外吸收低。

5、化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，也無變性作用，其化學組成不同于蛋白質(zhì)。

二、蛋白質(zhì)的等電點（pI）：

蛋白質(zhì)具有許多可解離的酸性基團（－COOH）和堿性基團（－NH₂）及其它基團，在一定溶液的pH條件下可解離成帶正電荷或負電荷的基團。當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH值時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的數(shù)目相等，成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點（pI）。

蛋白質(zhì)的等電點取決于它的氨基酸組成和構象，是一個物理化學常數(shù)。組成每一種蛋白質(zhì)、多肽的氨基酸數(shù)目和比例不同，蛋白質(zhì)的等電點范圍很寬，可利用等電點差異分離蛋白質(zhì)。

當pH＜pI時，溶質(zhì)帶正凈電，向陰極泳動，與電滲方向相同，溶質(zhì)遷移總速度比電滲速度快。

當pH＞pI時，溶質(zhì)帶負凈電，向陽極泳動，與電滲方向相反，溶質(zhì)遷移總速度比電滲速度慢。

當pH = pI時，正負解離相等，凈電荷為零，溶質(zhì)遷移速度和電滲速度相同。

三、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的介質(zhì)：

一般采用氨基酸和氨基聚合羧酸的緩沖液。

四、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的形成：

CIEF電泳的關鍵是pH梯度的形成，載體兩性電解質(zhì)pH梯度的介質(zhì)是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點后自然形成pH梯度。

在沒有電場時，載體兩性電解質(zhì)的pH值約是該溶液pH范圍的平均值，所有載體兩性電解質(zhì)分子都荷電。

當引入電場時，載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移，帶有最低等電點的分子（荷負電最多）將最快地向陽極移動，當它達到凈電荷為零的位置時才停止，這個位置靠近陽極，由于它具有高的緩沖能力，使環(huán)境溶液的pH等于分子本身的pI。一些低pI的載體兩性電解質(zhì)（荷負電次多）也向陽極移動，直到它的凈電荷減少到零時才停止。同樣，其周圍環(huán)境溶液pH值也等于它本身的pI。依次類推，所有的載體兩性電解質(zhì)分子用增加pI級數(shù)的方法將分別在陽極和陰極之間到達自己的位置，從而形成pH梯度。

五、工作原理：

CIEF電泳是利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度中進行分離。

毛細管內(nèi)充有載體兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀氫氧化鈉溶液。當施加直流電壓（6～8V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度。在電場作用下，蛋白質(zhì)在此pH梯度中泳動，當遷移至pH值等于pI處時，不再泳動，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。利用氣壓壓力將已等電聚焦的樣品推動，經(jīng)過檢測器進行檢測。

聚焦過程可用電流檢測，當聚焦完畢，無電流通過。蛋白質(zhì)只能在它的等電點位置被聚焦成一條窄而穩(wěn)定的區(qū)帶，可獲得非常高的分辨率。不同蛋白質(zhì)的等電點不同，能在CIEF電泳中聚焦成不同的區(qū)帶而得以分離。

六、特點：

1、優(yōu)點：

（1）具有極高的分辨率，區(qū)帶清晰且窄，通常可分離等電點差異小于0.01pH單位的兩種蛋白質(zhì)。

（2）可測定蛋白質(zhì)和多肽的等電點。

2、缺點：

（1）由于CIEF柱表面覆蓋物的不穩(wěn)定性限制了廣泛應用。

（2）需無鹽溶液，不適用于在等電點不溶解或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。

七、注意事項：

1、電滲流在CIEF電泳中不利，應消除或減小。

2、由于局部高度濃縮，可能會導致蛋白質(zhì)沉淀阻塞，需要加添加劑如聚乙烯醇（PVA）等對蛋白質(zhì)pI影響小的非離子表面活性劑。

3、由于通常所用載體兩性電解質(zhì)在低紫外有吸收，紫外吸收檢測通常在較高波長即280nm進行。

八、應用：

分離對象只限于蛋白質(zhì)和其它兩性分子，常用于同工酶的分離和pI測定，特別適合分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分。

在分離混合多肽物質(zhì)中應用不多，主要應用于分離不同來源的多肽異構體。

可用于分離其它方法無法分離的蛋白質(zhì)，如免疫球蛋白、血紅蛋白、血清轉鐵蛋白和低濃度生物樣品等。

   

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