反相鍵合相液相色譜儀又稱非極性鍵合相液相色譜儀，在高效液相色譜儀中占有重要地位。

一、分離機(jī)理：

有疏溶劑理論和雙保留機(jī)理。

1、疏溶劑理論：

疏溶劑理論認(rèn)為非極性烷基鍵合相是在硅膠表面蒙覆了一層以Si－C鍵化學(xué)鍵合的十八烷基（或其它烴基）的分子毛。溶質(zhì)分子（分析物）有非極性部分和極性官能團(tuán)部分組成。當(dāng)溶質(zhì)分子的非極性部分與極性溶劑接觸時，相互間產(chǎn)生斥力，此現(xiàn)象稱為疏溶劑。當(dāng)溶質(zhì)分子的極性部分與極性溶劑接觸時，相互間具有親和力。當(dāng)鍵合相表面的烷基（分子毛）與極性溶劑接觸時，相互間產(chǎn)生斥力。而當(dāng)溶質(zhì)分子的非極性部分與鍵合相表面的烷基（分子毛）接觸時，則相互間產(chǎn)生締合作用。這種締合作用是可逆的，締合作用的強(qiáng)弱決定溶質(zhì)分子色譜保留的強(qiáng)弱。

影響溶質(zhì)保留值的因素：

（1）溶質(zhì)分子結(jié)構(gòu)：

在一定的洗脫液和溫度下，溶質(zhì)分子的logk與溶質(zhì)分子中的非極性部分的總表面成正比。

溶質(zhì)分子中非極性部分相同，增加極性基團(tuán)，因為增加了溶質(zhì)分子與洗脫液的極性分子間的作用力而使k減小。

（2）烷基鍵合相特性：

烷基數(shù)量越多，溶質(zhì)保留越強(qiáng)。

烷基碳鏈越長，溶質(zhì)保留越強(qiáng)。

隨著烷基碳鏈的增長，增加了鍵合相的非極性作用的表面積，其影響溶質(zhì)的保留值和色譜柱的選擇性（即隨烷基碳鏈的增長，其對溶質(zhì)分離的選擇性增大）。

（3）流動相性質(zhì)：

流動相的表面張力越大，解締合時釋放的能量越多，k越大。

流動相極性越大，表面張力越小，k越小。

（4）溫度：

溫度升高，保留值降低，柱效提高。

2、雙保留機(jī)理：

雙保留機(jī)理包括疏溶劑效應(yīng)和親硅醇基效應(yīng)。

親硅醇基效應(yīng)認(rèn)為烷基鍵合相表面往往有殘余硅醇基，這是一種微量酸性基團(tuán)，可與溶質(zhì)陽離子或氫鍵基團(tuán)相互作用，主要影響含氮類藥物的分離，造成色譜峰拖尾，柱效下降。

可加入掃尾劑降低硅膠的吸附作用，常用的掃尾劑為有機(jī)堿類，如三乙胺等。

二、鍵合固定相：

鍵合固定相是在硅膠表面鍵合了非極性有機(jī)基團(tuán)（烴基硅烷）的固定相。

常見的烴基有丙基、己基、辛基、十六烷基、十八烷基和苯基。其中以十八烷基鍵合相（ODS或C₁₈）應(yīng)用最廣泛。

三、流動相：

溶劑極性越低，洗脫能力越強(qiáng)。

1、常用流動相：

（1）甲醇－水。

（2）乙腈－水。

（3）四氫呋喃－水。

溶劑強(qiáng)度為水＜甲醇＜乙腈＜四氫呋喃。

系統(tǒng)（2）較系統(tǒng)（1）好，原因如下：

系統(tǒng)（2）的粘度較系統(tǒng)（1）小，柱效好。粘度降低，柱壓降低，傳質(zhì)阻力降低（溶質(zhì)擴(kuò)散阻力降低）， 柱效升高。

乙腈的紫外末端吸收較甲醇小，在低波長處測定時，基線波動較甲醇小，測定誤差小。

2、流動相的選擇：

（1）二元溶劑系統(tǒng)：

一般以洗脫能力最弱的水作為底劑，再加入一定量的可與水互溶的有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑。常用的首選極性調(diào)節(jié)劑為甲醇和乙腈。

（2）多元溶劑系統(tǒng)：

在二元溶劑系統(tǒng)中加入少量的四氫呋喃，常能改善某些難分離的物質(zhì)對的分離度。

用水、甲醇、乙腈和四氫呋喃組成三元或四元溶劑系統(tǒng)，并進(jìn)行優(yōu)化，選出最佳溶劑系統(tǒng)。

3、溶質(zhì)保留值隨溶劑極性變化的一般規(guī)律：

有機(jī)溶劑比例減小：

（1）溶劑的極性增加，洗脫能力降低，溶質(zhì)的保留時間增加。

（2）不同溶質(zhì)組分間的分離度增加。

（3）溶質(zhì)的柱效降低。

   

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