高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳色譜儀（CZE）又稱自由溶液區(qū)帶電泳儀，整個系統(tǒng)采用同一種緩沖液充滿，以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，利用荷電粒子之間的淌度差異進(jìn)行分離。

一、工作原理：

CZE中，粒子的電荷性質(zhì)不同，電泳方向不同；粒子的電荷數(shù)量不同，電泳速度不同；粒子的分子量不同，電泳速度不同。在毛細(xì)管中，由于電滲流的存在，所有粒子都隨電滲流一起向負(fù)極遷移，電滲流速度約是一般離子電泳速度的5～7倍。各種電性粒子在毛細(xì)管中的遷移速度分別為：

1、陽離子：v_ap = v_eo+ v_ep，陽離子電泳方向與電滲流方向一致。

2、陰離子：v_ap = v_eo－v_ep，陰離子電泳方向與電滲流方向相反。

3、中性粒子：v_ap = v_eo，中性粒子運動方向與電滲流方向一致。

當(dāng)樣品從陽極端注入毛細(xì)管時，不同電性的粒子將按不同速度向負(fù)極遷移，從負(fù)極端先后流出毛細(xì)管，出峰順序依次是陽離子、中性粒子和陰離子。中性粒子無電泳現(xiàn)象，隨電滲流同行，在陽離子后流出，但不同結(jié)構(gòu)的中性粒子無法相互分離（電泳圖上是一個峰）。

電滲流在CZE中起著極其重要的作用：

1、電滲流具有象HPLC中泵一樣的作用，推動粒子前進(jìn)，加上不同粒子電泳速度和方向的差異，完成陽離子、陰離子和中性粒子的分離。

2、改變電滲流速度的大小和方向，可改變分離效率和選擇性。這是CZE優(yōu)化分離的重要因素。

3、電滲流速度的微小變化會影響分離結(jié)果的重現(xiàn)性（遷移時間和峰面積）。

二、特點：

1、毛細(xì)管不涂敷任何固定液。

2、結(jié)構(gòu)簡單，操作方便。

3、不能分離電中性組分，因為電中性組分的淌度差為零。

4、不能分離質(zhì)荷比相近的組分，如蛋白質(zhì)－SDS絡(luò)合物。

三、定性和定量分析：

1、定性依據(jù)：不同組分的遷移時間不同。

2、定量依據(jù)：電泳峰面積或峰高。

四、操作條件：

CZE操作條件包括緩沖液、添加劑、分離電壓和分離溫度等選擇。

1、緩沖液：

CZE分離過程在緩沖液中進(jìn)行，緩沖液的選擇直接影響粒子的遷移和分離。

配制緩沖液時，必須使用高純蒸餾水和試劑。使用前要用0.45μm濾膜過濾以除去顆粒等。

（1）選擇緩沖液應(yīng)遵循的條件：

1）在所選擇的pH范圍內(nèi)有很好的緩沖容量。

2）在檢測波長處無吸收或吸收值低。

3）為達(dá)到有效的進(jìn)樣和合適的電泳淌度，緩沖液pH值至少與被測組分的等電點相差l個pH單位。

4）自身淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產(chǎn)生。

5）只要條件允許，盡可能采用酸性緩沖液。在低pH值下，吸附和電滲流都很小，毛細(xì)管涂層的壽命較長。

6）與毛細(xì)管種類匹配，涂層毛細(xì)管只能在一定pH范圍內(nèi)使用。

（2）緩沖液pH值的選擇：

1）緩沖液pH值的選擇與樣品性質(zhì)有關(guān)。

①通常酸性組分選擇在堿性條件下分離。

②通常堿性組分選擇在酸性條件下分離。

③蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等兩性物質(zhì)可選酸性（pH = 2）或堿性（pH＞9）分離介質(zhì)。

④糖類樣品通常在pH = 9～11能獲得最優(yōu)分離。

⑤羧酸或其它樣品多在pH = 5～9選擇分離條件。

2）緩沖液pH值的選擇和毛細(xì)管種類有關(guān)。

很多涂層毛細(xì)管只能在一定pH范圍內(nèi)使用，如聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管只能在pH = 4～9使用，否則涂層易水解失效。

3）在相同pH下，不同緩沖液的分離效果可能相差很大。

一般來說，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑可能是最好的。如分離糖類和DNA等分子時應(yīng)優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖液，因為硼酸根能與糖羥基形成配位鍵，增加糖的負(fù)電荷和分離度。硼酸鹽緩沖液也適用于分離其它含鄰羥基和多羥基的化合物。

4）為了選擇合適的pH值，需要用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)整介質(zhì)的酸堿性。

由于多數(shù)緩沖試劑是酸性物質(zhì)如磷酸，所以pH調(diào)節(jié)劑主要是堿類。常用pH調(diào)節(jié)劑有NaOH、KOH和Tris等。也可用胺和醇胺等有機(jī)堿如乙醇胺和乙二胺。如果緩沖試劑為堿類，可用酸作為調(diào)節(jié)劑，盡量使用弱酸如H₃PO₄。

緩沖試劑和調(diào)節(jié)劑的濃度對改善分離、抑制吸附和控制焦耳熱等都有影響。一般緩沖試劑的濃度在10～200mmol/L，有時為了抑制蛋白質(zhì)等的吸附作用，濃度可高達(dá)500mmol/L（此時應(yīng)減少分離電壓）。電導(dǎo)率大的緩沖試劑如磷酸鹽和硼酸鹽等的濃度一般在20mmol/L，電導(dǎo)率小的緩沖試劑如硼酸的濃度可在100mmol/L以上。

2、添加劑：

如果緩沖液經(jīng)各種參數(shù)優(yōu)化后仍無法給出良好的分離結(jié)果，可加入添加劑以改善分離。常用添加劑有：

（1）無機(jī)電解質(zhì)：NaCl和KCl等。

（2）有機(jī)溶劑：甲醇和乙腈等。

（3）非電解質(zhì)高分子：纖維素、多糖、聚乙烯醇和Triton X－100等。

（4）功能性添加劑：手性冠醚和環(huán)糊精等。

3、分離電壓：

分離電壓是控制柱效、分離度和遷移時間的重要因素。分離電壓與毛細(xì)管內(nèi)徑和長度及緩沖溶液濃度（離子強(qiáng)度）有關(guān)，電壓的極值范圍因系統(tǒng)和組成而異。

當(dāng)柱長一定時，在一定電壓范圍內(nèi)，電壓與粒子的遷移速度成線性關(guān)系。

當(dāng)電壓過高時，線性關(guān)系偏移，主要是由高電壓引起的焦耳熱造成的。電壓升高，產(chǎn)生的焦耳熱增多，在不能有效驅(qū)散所產(chǎn)生焦耳熱的情況下，柱溫會顯著升高，工作電流增大，柱效和分離度降低。除了采取有效的散熱措施外，選擇合適的條件，使在此條件下允許使用較高電壓，而不致產(chǎn)生過大的電流和過多的焦耳熱，是非常重要的。一般通過作I－V曲線來選擇體系的最優(yōu)分離電壓。

4、分離溫度：

毛細(xì)管的溫度不僅影響分離的重視性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮熱效應(yīng)、分析重現(xiàn)性、分離效率和分離介質(zhì)對溫度的限制等因素。

溫度應(yīng)通過實驗確定。多數(shù)情況下，在20～30℃進(jìn)行電泳能獲得良好的分離效果。一些糖類樣品需要高于室溫的分離條件，一些樣品如蛋白質(zhì)等可能需要低于室溫的分離條件。

五、應(yīng)用：

CZE是CE最基本、應(yīng)用最廣的分離模式。

可分離蛋白質(zhì)、多肽和帶電荷的大小分子。

   

來源：http://www.fudizao.com