高效毛細(xì)管電色譜儀（CEC）是在毛細(xì)管柱中填充固定相顆粒、管壁鍵合或涂覆固定相、制成連續(xù)床固定相，以電滲流或電滲流與壓力共同驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，利用樣品各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)差異和本身淌度差異進(jìn)行分離。電色譜柱是CEC的核心部件，按固定相形式不同可分為填充毛細(xì)管柱、開管毛細(xì)管柱和整體毛細(xì)管柱。

一、填充毛細(xì)管柱：

填充毛細(xì)管柱是將固定相填充到毛細(xì)管中，通過兩端燒結(jié)柱塞將固定相保持在毛細(xì)管中而成。其最大優(yōu)點(diǎn)是可利用眾多的HPLC固定相，根據(jù)化合物與固定相的作用不同實(shí)現(xiàn)高效分離，在CEC中應(yīng)用最廣泛。

1、固定相：

固定相是影響填充毛細(xì)管柱分離選擇性、柱效和分離速度的重要因素，是發(fā)展新型CEC分離模式的基礎(chǔ)。

HPLC的各種固定相已被應(yīng)用于CEC中，其中十八烷基硅烷鍵合硅膠固定相（ODS）最多。由于CEC是以電滲流驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，不存在柱壓降問題，可采用粒徑很小的固定相，以提高柱效。實(shí)驗(yàn)表明，只要固定相顆粒粒徑≥0.5μm，電滲流速度與固定相顆粒大小和填充均勻程度無關(guān)，所以分離效率高，重復(fù)性好。

混合官能團(tuán)固定相是專門針對CEC研制的新型固定相，是在硅膠表面同時(shí)鍵合具有反相色譜性能的烷基官能團(tuán)和具有離子交換性質(zhì)的磺酸官能團(tuán)，在很寬的pH范圍內(nèi)都能保持良好的電滲流。

2、制備方法：

（1）柱塞：

柱塞制備對填充毛細(xì)管柱非常關(guān)鍵。

1）柱塞必須滿足的要求：

①有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，能承受填充時(shí)的高壓。

②化學(xué)惰性，耐有機(jī)溶劑和寬pH值的緩沖液。

③有合適的孔隙度，既不使流動(dòng)相受阻，又可防止固定相顆粒通過。

④死體積小，避免峰展寬。

2）柱塞制備方法：

柱塞制作方法很多，目前應(yīng)用較多的是水玻璃燒制法和填料直接燒制法。

（2）填充毛細(xì)管柱：

填充毛細(xì)管柱的填充方法有高壓勻漿填充法、電動(dòng)填充法和超臨界CO₂法等。

1）高壓勻漿填充法：

高壓勻漿填充法是填充毛細(xì)管柱最常用的制備方法。

填充過程一般包括燒結(jié)進(jìn)樣端柱塞、高壓填充、燒結(jié)出口端柱塞、除去不需要的固定相和檢測窗口制作等步驟。

高壓勻漿填充法簡單，快速，但操作技術(shù)要求較高。由于在分離樣品時(shí)施加電場，會(huì)使表面帶電荷的固定相沿某一方向電泳，容易造成柱局部過于緊密產(chǎn)生較大的壓力，而局部由于固定相遷移形成較大的空隙。

2）電動(dòng)填充法：

電動(dòng)填充是利用電泳原理，使固定相在一定pH下帶電荷，在電場中定向移動(dòng)而把固定相填充到毛細(xì)管中。與高壓勻漿填充法相比，電動(dòng)填充法可有選擇地把荷質(zhì)比相同的固定相填入毛細(xì)管中，柱床均勻。

3）超臨界CO₂法：

超臨界CO₂法是在毛細(xì)管柱一端制作臨時(shí)柱塞后，另一端與貯液罐相連，將預(yù)填充的填料放入貯液罐中，然后利用超臨界CO₂將填料填入毛細(xì)管中，再緩慢釋放壓力至常壓而得到干的色譜柱。柱使用前用流動(dòng)相潤洗，平衡。

3、特點(diǎn)：

（1）優(yōu)點(diǎn)：

1）柱效高。

2）固定相資源豐富。

（2）缺點(diǎn)：

1）存在柱塞制備和柱填充，步驟繁瑣。

2）重現(xiàn)性差。

4、氣泡問題：

填充毛細(xì)管柱CEC操作的困難是分離過程中常伴有氣泡產(chǎn)生。氣泡一般產(chǎn)生在柱塞與固定相交界處和柱塞與檢測窗口交界處。為了控制氣泡產(chǎn)生，目前主要采取以下措施：

（1）在柱兩端同時(shí)施加低壓，可較好的解決氣泡問題。

（2）制備滲透性好的柱塞。

（3）在分流閥處接一阻尼管，當(dāng)電極處有氣泡產(chǎn)生時(shí)，氣泡會(huì)經(jīng)分流閥通過阻尼管排出。

（4）利用超聲波使流動(dòng)相和樣品充分脫氣。

二、開管毛細(xì)管柱：

開管毛細(xì)管柱是將固定相鍵合或涂敷在毛細(xì)管壁上，引入色譜分配機(jī)理。

1、制備方法：

開管毛細(xì)管柱制備的關(guān)鍵是增大比表面積，以制備相比大和柱容量大的色譜柱。

（1）鍵合固定相。

（2）涂覆聚合物固定相。

（3）溶膠－凝膠法。

（4）分子印記法。

2、特點(diǎn)：

（1）優(yōu)點(diǎn)：

1）與填充毛細(xì)管柱相比，由于沒有渦流擴(kuò)散，分離效率更高，分離時(shí)間大大縮短。

2）由于不用柱塞，制備簡單，減小了氣泡產(chǎn)生的可能性。

（2）缺點(diǎn)：

開管毛細(xì)管柱的相比是填充毛細(xì)管柱的1/350，柱容量小，對溶質(zhì)的保留有限。

為了增加相比和柱容量，開管毛細(xì)管柱一般使用比較細(xì)的毛細(xì)管（＜25μm），通過各種方法對管壁進(jìn)行處理。

三、整體毛細(xì)管柱：

整體毛細(xì)管柱是采用有機(jī)和無機(jī)方法在毛細(xì)管中進(jìn)行原位自由基聚合反應(yīng)或固化，形成連續(xù)床固定相。目前是電色譜柱研究的熱點(diǎn)。

整體毛細(xì)管柱一般采用柱內(nèi)直接鍵合的方法形成整塊多孔的交聯(lián)聚合物，不用柱塞，簡化了柱制備過程。通過改變單體可引入多種官能團(tuán)，有更好的多孔性和滲透性，對流動(dòng)相阻力小，溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間快速分配，有利于實(shí)現(xiàn)高速分離。可對生物大分子進(jìn)行快速分離。

按基質(zhì)不同可分為無機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱、有機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱、顆粒固定化整體毛細(xì)管柱和雜化材料整體毛細(xì)管柱。

1、無機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱：

無機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱是通過溶膠－凝膠反應(yīng)使硅烷化試劑形成牢固的Si－O－Si網(wǎng)絡(luò)骨架。溶膠－凝膠反應(yīng)一般包括至少一種前導(dǎo)物質(zhì)（通常是烷氧基硅烷）、溶劑、催化劑、有機(jī)添加劑和水，將這些物質(zhì)的溶液引入經(jīng)預(yù)處理的毛細(xì)管后，在柱中水解縮聚生成凝膠，然后進(jìn)行老化、干燥，制成硅膠基質(zhì)整體毛細(xì)管柱。

在溶膠－凝膠反應(yīng)過程中，催化劑HCl和單體含量對整體柱的結(jié)構(gòu)有影響。增加HCl濃度可增加柱強(qiáng)度，增加分離效率。當(dāng)HCl濃度低時(shí)，沒有足夠的硅醇基水解形成網(wǎng)絡(luò)骨架。增加單體和致孔劑的比率會(huì)減小孔徑，增加骨架密度，降低滲透性。當(dāng)單體濃度小于5%時(shí)，單體只能與管壁結(jié)合，不能形成整體柱。當(dāng)單體濃度大于18%時(shí)，柱滲透性非常差。

溶膠－凝膠技術(shù)具有純度高、均勻性好和合成溫度低等特點(diǎn)，近年在材料科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

硅膠基質(zhì)整體毛細(xì)管柱機(jī)械強(qiáng)度良好，耐有機(jī)溶劑，硅膠骨架和通孔尺寸可獨(dú)立控制，但使用過程會(huì)出現(xiàn)收縮、開裂和干結(jié)等問題，很多情況下柱制備和修飾不能同時(shí)進(jìn)行。

另外，還有以氧化鋯和二氧化鈦為基質(zhì)的整體柱，但這方面的研究遠(yuǎn)不及硅膠基質(zhì)整體毛細(xì)管柱廣泛和深入。

2、有機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱：

有機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱有以聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯為基質(zhì)的整體柱。典型的聚合液以含一個(gè)乙烯基的化合物為單體，以含兩個(gè)乙烯基的化合物為交聯(lián)劑，以含離子基團(tuán)的化合物為產(chǎn)生電滲流的單體，為了形成多孔結(jié)構(gòu)往往添加致孔劑。

有機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱種類比較單一，機(jī)械強(qiáng)度較差，容易發(fā)生收縮和溶漲現(xiàn)象，使柱性能發(fā)生變化，影響柱壽命。

（1）聚丙烯酰胺基質(zhì)整體毛細(xì)管柱：

以聚丙烯酰胺為基質(zhì)的整體柱從1995年首次出現(xiàn)以來得到了廣泛應(yīng)用。最初的整體柱一般以丙烯酰胺為單體，以亞甲基二丙烯酰胺為交聯(lián)劑，以含離子基團(tuán)的化合物為產(chǎn)生電滲流的單體，所得到的整體柱是親水性較強(qiáng)的柱床。為了獲得疏水性較強(qiáng)的柱床，可添加疏水性較強(qiáng)的單體，如十四烯、十六烯和十八烯等，利用反相機(jī)制進(jìn)行分離。

（2）聚甲基丙烯酸酯基質(zhì)整體毛細(xì)管柱：

以聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的整體柱是硬質(zhì)柱床，柱制備比較簡單，毛細(xì)管壁可不經(jīng)過預(yù)處理將聚合物混合液引入到柱中后，經(jīng)水熱處理可得到柱體與管壁結(jié)合很好的整體柱。

以2－（三甲基磺酸甲酯銨）乙基甲基丙烯酸酯（MEAMS）為單體，以乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，以正丙醇和1，4－丁二醇的混合液為致孔劑，可得到具有反相和離子交換混合模式的整體柱。MEAMS中的銨基既作為產(chǎn)生反向電滲流的基團(tuán)，又作為強(qiáng)離子交換固定相。該整體柱對中性化合物表現(xiàn)出反相色譜機(jī)制，對帶電荷的物質(zhì)既有反相作用機(jī)制，又有離子交換作用機(jī)制。使用該整體柱分離堿性化合物時(shí)，還消除了一般電泳和電色譜中由于堿性化合物吸附所造成的峰拖尾現(xiàn)象。

（3）聚苯乙烯基質(zhì)整體毛細(xì)管柱：

以聚苯乙烯為基質(zhì)的整體柱是硬質(zhì)整體柱。目前單體種類比較少，一般是苯乙烯－二乙烯苯共聚物。

3、顆粒固定化整體毛細(xì)管柱：

顆粒固定化整體毛細(xì)管柱是將填料的溶膠－凝膠懸浮液引入毛細(xì)管中進(jìn)行原位聚合，或?qū)⑻盍项w粒填充到毛細(xì)管中后，再采用如高溫?zé)�結(jié)、溶膠－凝膠等方式，形成連續(xù)床層的整體柱。由于顆粒的存在，減少了柱制備過程中的收縮和干裂。

4、雜化材料整體毛細(xì)管柱：

采用有機(jī)－無機(jī)雜化的方法，使整體柱的形成和衍生同時(shí)完成。柱制備簡單，可通過調(diào)節(jié)不同前導(dǎo)物質(zhì)的比例來調(diào)整疏水相在整體柱中的比例。

   

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