影響反相離子對色譜儀色譜保留的因素有流動相pH值、離子對試劑種類、離子對試劑濃度、有機溶劑性質、有機溶劑濃度、緩沖鹽濃度和柱溫等。

一、流動相pH值：

反相離子對色譜常用的流動相是甲醇－水、乙腈－水，流動相中一般含有3～10mol/L的離子對試劑。

流動相pH值決定離子化合物的解離度，合適的pH值是反相離子對色譜的重要條件。為了使化合物最大程度的解離，獲得合適的保留和響應，又不超出硅膠基質色譜柱的承受范圍，一般流動相pH = 2～7.5。

強酸性樣品在低pH值能充分解離，對流動相pH值要求不嚴。對于弱酸性樣品需在高pH值時才能充分解離，若pH值過低，則抑制解離，樣品組分呈不解離溶質，故這些樣品不太適合采用pH值分析。

堿性樣品的分析可控制在較低pH值，能在色譜柱適應的范圍內(nèi)較方便的進行反相離子對色譜分析。

二、離子對試劑種類：

離子對試劑種類決定于被測樣品的性質，通常選用與被測樣品電荷相反的離子對試劑。

1、常用離子對試劑和主要應用對象。

（1）離子對試劑：烷基磺酸鹽，如庚烷磺酸鹽和樟腦磺酸鹽等。

主要應用對象：強堿、弱堿、兒茶酚銨和肽類。

（2）離子對試劑：烷基磺酸鹽，如辛基和十二烷基磺酸鹽等。

主要應用對象：強堿、弱堿、兒茶酚銨和肽類。

（3）離子對試劑：季銨鹽，如四丁溴化銨和十六烷基三甲銨等。

主要應用對象：強酸、弱堿及其鹽類。

（4）離子對試劑：叔胺，如三辛銨。

主要應用對象：磺酸鹽和羧酸。

（5）離子對試劑：高氯酸。

主要應用對象：胺。

2、不同種類的離子對試劑所形成的離子對在固定相上的保留不同。

對于同一類離子對試劑，其碳鏈長度不同，疏水性不同。離子對試劑的碳鏈越長，所形成的離子對越易在固定相上保留。反之，碳鏈越短，離子對的保留值越小。

（1）同一類離子對試劑中，親水性基團（如－OH、－COOH和－NH₂）數(shù)目越多，形成的離子對的保留值越小；疏水性基團（如芳基）數(shù)目越多，形成的離子對的保留值越大。

（2）烷基胺（銨）類離子對試劑所形成的離子對的保留順序大致為季銨離子＜伯胺離子＜仲胺離子＜叔胺離子。

（3）不同無機陰離子的同一類離子對試劑所形成的離子對的保留順序為Clˉ＜Brˉ＜Iˉ＜ClO₄ˉ。

三、離子對試劑濃度：

當流動相中離子對試劑濃度增加，被固定相吸附的離子對試劑濃度增加，直至固定相上的離子對試劑飽和。由于樣品保留主要取決于吸附在固定相上的反離子濃度，因此，隨著流動相中離子對試劑的逐步增加，樣品保留也逐步增加到極大值，若繼續(xù)增加離子對試劑濃度，樣品保留不但不增加，反而會減少。這是因為離子對試劑的反離子，如四丁基氯化銨（TBA⁺Clˉ）中Clˉ與樣品離子（COOˉ）競爭保留在（TBA⁺）上。故一般流動相中的離子對試劑濃度為3～10mol/L。

四、有機溶劑性質：

有機溶劑種類可能改變選擇性，但同時要考慮到離子對試劑的溶解度。多數(shù)季銨鹽和磺酸鹽可溶于甲醇，在乙腈中的溶解度較小，若增加乙腈中的含水量（約10%～20%），溶解度會增加。十二烷基硫酸鈉在乙腈中的溶解度大于在甲醇中的溶解度。

五、有機溶劑濃度：

流動相中有機溶劑的比例增加，吸附在固定相上的離子對試劑減少，可選擇性的降低離子型化合物的保留。有機溶劑的比例越高，k值越小。被測組分的疏水性和離子對試劑的疏水性越強，所需有機改性試劑的濃度越高。一般調(diào)節(jié)有機溶劑的比例使化合物的保留在0.5＜k＜20。

六、緩沖鹽濃度：

流動相中緩沖鹽的濃度增加，樣品保留下降。

七、柱溫：

在進行反相離子對色譜分析時，應特別注意色譜系統(tǒng)的恒溫條件，以保證分離的重現(xiàn)性。

   

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