高效液相色譜儀流動相的選用要求包括流動相性質(zhì)要求、流動相選擇、流動相pH值、流動相脫氣、流動相過濾、流動相貯存、鹵代溶劑應(yīng)特別注意的問題和HPLC用水等方面。

一、流動相性質(zhì)要求：

HPLC中，強(qiáng)溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少，相應(yīng)的容量因子k值減小；較弱的溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附增加，相應(yīng)的容量因子k值增大。因此，k值是流動相組成的函數(shù)。理論塔板數(shù)一般與流動相的粘度成反比。

1、流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)：

低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機(jī)相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。

堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。

酸性流動相不能用于氧化鋁和氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

2、純度高：

色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。

3、必須與檢測器匹配：

當(dāng)使用UVD時，所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收或吸收很小。

當(dāng)使用RID時，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。

4、粘度低：

高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴(kuò)散和傳質(zhì)，使柱效降低，還會使柱壓增加，分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。

5、對樣品的溶解度要適宜：

如果溶解度欠佳，樣品會在色譜柱內(nèi)沉淀，不但影響純化分離，而且會使色譜柱惡化。

6、樣品易于回收：

應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。

二、流動相選擇：

HPLC中，溶劑的洗脫能力與溶劑極性相關(guān)。

1、正相色譜的流動相：

在正相色譜中，溶劑強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加。

正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。

2、反相色譜的流動相：

在反相色譜中，溶劑強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而減弱。

反相色譜的流動相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑（如甲醇、乙腈和四氫呋喃等）。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及所占比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇－水系統(tǒng)滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動相粘度小，價格低，是反相色譜最常用的流動相。

乙腈－水系統(tǒng)與甲醇－水系統(tǒng)相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，可滿足在紫外185～205nm處檢測的要求，綜合來看，乙腈－水系統(tǒng)優(yōu)于甲醇－水系統(tǒng)。

在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，需采用梯度洗脫。

三、流動相pH值：

采用反相色譜分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調(diào)節(jié)流動相pH值，以抑制樣品組分的解離、增加組分在固定相上的保留和改善峰形的技術(shù)，稱為反相離子抑制。

1、弱酸樣品：

對于弱酸樣品，流動相pH值越小，組分k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸pKa值時，弱酸主要以分子形式存在。

分離弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液。

2、弱堿樣品：

對于弱堿樣品，情況與弱酸樣品相反。

分離弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

流動相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象，在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）稱為減尾劑或除尾劑。

四、流動相脫氣：

1、流動相脫氣的原因：

HPLC所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵工作、柱分離效率、檢測器靈敏度和基線穩(wěn)定性，甚至無法檢測。

（1）流動相中的溶解氧可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。

（2）溶解氧會引起溶劑pH變化，給分析結(jié)果帶來誤差。

（3）溶解氧能與某些溶劑（如甲醇和四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），導(dǎo)致檢測靈敏度輕微降低，更重要的是在梯度洗脫時會造成基線漂移或形成鬼峰。除去溶解氧將大大提高UVD的性能。

（4）在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛和酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。除去溶解氧將改善在一些熒光檢測中的靈敏度。

（5）在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），溶解氧的影響更大。

2、常用脫氣方法：

有吹氦脫氣法、加熱回留法、超聲波脫氣法、抽真空脫氣法和在線真空脫氣法等。

五、流動相過濾：

所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm或0.22μm濾膜過濾，以除去雜質(zhì)微粒。色譜純試劑也不例外，除非在標(biāo)簽上標(biāo)明已過濾。

用濾膜過濾時，要注意分清有機(jī)相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。

有機(jī)相濾膜一般用于過濾有機(jī)溶劑，過濾水溶液時流速低或過濾不動。

水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑。否則濾膜會被溶解，溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。

對于混合流動相，可在混合前分別過濾。如需混合后過濾，首選有機(jī)相濾膜。現(xiàn)已有混合型濾膜。

六、流動相貯存：

流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因為許多有機(jī)溶劑（如甲醇和乙酸等）可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑被污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，防止氧和二氧化碳溶入流動相。

磷酸鹽和乙酸鹽緩沖液很容易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新過濾。

容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的容器，以除去容器底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的容器無此現(xiàn)象。

七、鹵代溶劑應(yīng)特別注意的問題：

1、鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。

2、鹵代溶劑與水的混合物比較容易反應(yīng)，不能存放太久。

3、鹵代溶劑（如CCl₄和CHCl₃）等與各種醚類（如二異丙醚和四氫呋喃等）混合后，可能會反應(yīng)生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動相應(yīng)盡量不采用或新鮮配制。

4、鹵代溶劑（如CH₂Cl₂）與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑（如乙腈）混合靜置時，會產(chǎn)生結(jié)晶。

總之，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產(chǎn)生類似問題。

八、HPLC用水：

HPLC應(yīng)用中要求用超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。

   

來源：http://www.fudizao.com